最新科研动态,为您提供最新的科研方法,加速您的科研!

RNA专用转染试剂,高效转染

作者:科研助手 阅读:4926次 时间:2017-07-03 13:49:25

EntransterTM-R4000

(用于将RNA转染入动物细胞)

使用手册

产品介绍

本品推荐用于将siRNAmicroRNA(miRNA)mimicinhibitor等小片断RNA转染入动物细胞(包括各种细胞系、原代细胞、悬浮细胞、昆虫细胞等)。

本品在多种细胞系的验证中均表现了很好的RNA转染效率,并有很低的细胞毒性,而较低的细胞毒性对RNAi实验尤其重要。

重要提示

1.由于本品细胞毒性很低,所以采用本品进行转染的细胞数量相对较少,这有助于提高转染效率。

2.采用本品进行转染,RNA用质量(ug)进行计量,对21nt双链的siRNA来说,1OD=3.0nmol=40ug

3.siRNA等较短RNA请参照表1siRNA用量,mRNAshRNA等较长RNA请参照表1mRNA用量。

4.如转染后需要用Trizol提取RNA,建议转染后6小时换液。

实验过程(以24孔板siRNA转染为例)

1.提前1天细胞种植

贴壁细胞:提前一天将细胞种植在24孔板中,以转染时细胞汇合度(Confluence)在30%左右为宜,转染前全培养基总量为0.45ml

悬浮细胞:采用对数生长期的细胞,数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105,那么就用2×105的细胞进行转染。

2.转染过程

⑴取0.67ug(50pmol)siRNA,加入一定量无血清稀释液,充分混匀,制成RNA稀释液,终体积为25μl

注意:无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM1640

⑵取1ulEntransterTM-R4000然后加入24ul无血清稀释液体,充分混匀,制成EntransterTM-R4000稀释液,终体积为25μl。室温静置5分钟。

⑶将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)混合,室温静置15分钟。转染复合物制备完成。

⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基(可含10%血清和抗生素)的细胞上,前后移动培养皿,混合均匀。

注意:对本试剂,采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

⑸转染后6小时观察细胞状态,如状态良好可不必更换培养基,继续培养24-96小时得到结果。

注意:1.siRNA转染后,继续培养24-72小时在mRNA水平得到结果,继续培养24-96小时在蛋白水平得到结果。mRNA转染后,根据需要在24小时后得到结果。

2.在部分实验室,由于血清和培养条件等差异,转染后镜下培养基中可能出现少量黑点状沉淀,为转染试剂和血清中蛋白结合产物,不影响转染结果和细胞状态,可通过换液除去。

1 不同细胞培养容器转染推荐用量

细胞培养容器

表面积(cm2)

共享试剂

siRNA等较短RNA

mRNAshRNA等较长RNA

培养基总量

稀释液体积

siRNA用量

EntransterTM-R4000

mRNA用量

EntransterTM-R4000

96-well

0.3

100μl

10μl

0.15μg

0.25μl

0.25μg

0.375μl

48-well

0.7

200μl

15μl

0.3μg

0.5μl

0.5μg

0.75μl

24-well

1.9

500μl

25μl

0.67μg

1μl

1μg

1.5μl

12-well

3.8

1ml

25μl

1.33μg

2μl

2μg

3μl

6-well/35-mm

10

2.5ml

50μl

3.33μg

5μl

5μg

7.5μl

60 mm/T25 flask

21

5ml

125μl

6.67μg

10μl

10μg

15μl

100 mm/T75 flask

58

15ml

250μl

20.0μg

30μl

30μg

45μl











 

优化

由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。下表列出了在24well的优化方案,供参考。

RNA浓度和转染试剂量的优化(24well)


1

2

3

4

RNA工作浓度

25nM

50nM

100nM

150nM

每孔RNA的量(pmol)

0.17μg

(12.5pmol)

0.33μg

(25pmol)

0.67μg

(50pmol)

1μg

(75pmol)

每孔转染试剂量

0.25μl

0.5μl

1μl

1.5μl

 

根据优化实验结果,固定RNA(μg):转染试剂量(μl)的比值,按培养器皿表面积比例应用到其他培养容器。

常见问题与解决方案

问题

可能原因

解决方案

转染后沉默现象不明显

RNA与转染试剂比例不佳

预实验优化

细胞密度不佳

调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%

RNA效率不高

选择最优RNA,并采用已知高效的RNA做对照

RNA酶污染

建议无RNA酶和内毒素的吸头、离心管和溶液等材料和实验器具。

转染后培养时间不够

mRNA水平可以到48小时以后验证结果,在蛋白水平可以到72小时后验证结果

细胞毒性

RNA与转染试剂比例不佳

预实验优化

细胞密度不佳

调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%

培养基毒性

采用含10-20%血清的全培养基

细胞污染

建议彻底清洁所有细胞培养相关用品

 


分享:1
向上