Advanced Cell Diagnostics, Inc.(ACD)创立于2006年,坐落于美国加利福尼亚州的硅谷中心,作为新兴的分子病理诊断的领导者,开发了基于细胞和组织测试的RNAscope®专利技术和定量平台, 并可应用于个体化医疗领域。 RNAscope®专利的探针设计提供了一种单细胞单分子水平的RNA原位杂交定量分析方法,是原位杂交领域重大的进步之一,为药物研发及生命科学研究提供了有力的工具。

聚焦创新:当ISH遇上IHC

作者:ACD-editor 阅读:251次 时间:2017-10-31 16:58:14

目前,国际上有些科学家,他们根据自己的科研需求,探索出RNA与蛋白共定位的优化方案,并以此完成研究,发表高分文献。使用者根据自己的研究需要也开始开发ISH - IHC双标记法,以便在同一载玻片同时进行两种检测分析。下面就让小编带您走进ISH-IHC双标记法!


RNA原位杂交(ISH)和免疫组化(IHC)是公认的在形态学背景下对RNA和蛋白表达进行定量的检测方法。ISH和IHC作为互补性技术,弥补了RNA和蛋白质分析之间的空缺。

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通过同时靶向不同的分子(RNA或蛋白质),ISH和IHC双标记法可以研究:

1、确定分泌蛋白的来源 — ISH识别产生蛋白的细胞,IHC鉴定循环蛋白分泌位置

2、确定复杂的组织结构 —组织结构中包含多种细胞类型,IHC确定细胞的类型,ISH用于检测RNA在上述细胞内的表达

3、明确基因表达调控 — 翻译水平调控可以抑制蛋白质合成,而蛋白质的不稳定性会导致IHC染色效果不佳。在同一组织中对RNA和蛋白质表达同时进行分析,可以区分转录抑制和蛋白质不稳定性的表达调控

4、评估基因治疗 — ISH和IHC双标记可以有效对比转导水平和蛋白质水平。由于翻译调控或者蛋白质的不稳定性的影响,信号的成功转导并非意味着可以转化成蛋白质表达。

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在同一样本使用同一制备方法准备的载玻片上同时进行ISH和IHC,具有诸多益处,如图1所示,实验流程可以有多种操作方式。

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ISH-IHC双标记法,我们有幸和其中的两位科学家进行了深入的沟通,咱们一起来看看这些科学家们对此研究方案的建议和指导吧!

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Q: 您在Novartis Institutes for BioMedical Research, Cambridge, MA, USA.工作,能谈谈您的工作以及您开发ISH-IHC双标记法初衷吗?


Kristie Wetzel

我是一名在诺华发育和分子通路实验室工作的研究员。我们团队除了向我们自己的实验室提供免疫组化(IHC)和原位杂交(ISH)服务外,还向从事不同疾病领域的其他团队提供服务。也就是说,根据特定研究内容,我们的组织样本类型多样,包括人体组织、小鼠组织、大鼠组织等。

我们开发ISH-IHC双标记法,主要是因为我们希望能够观察mRNA在何处积累。我们想确定到底是哪种组织以及哪种细胞产生该mRNA。这也就是RNAscope? ISH在我们的工作中十分重要的原因,以及我们使用它的原因。在进行检测分析时,会出现靶标找不到合适抗体或分析分泌蛋白时难以使用抗体的情况。我们进行ISH和IHC双标记检测,通过IHC明确细胞的特定类型,通过ISH明确mRNA的情况,因此我们便对它产生了极大的兴趣。


Q: 您是如何构建您的ISH-IHC双标记法?是否出现过一些具有挑战性的情况?

Kristie Wetzel

我们使用双标记法进行了测试,当时检测的靶标为溶菌酶蛋白,我们首先进行显色RNAscope? 分析试验(RNAscope?VS Red),随后进行免疫荧光染色。上述两个检测均在DISCOVERY系统(Ventana)上进行自动化检测。为了构建这个检测方法,我们首先确保在我们的组织样本中能成功进行RNAscope?分析,然后我们对IHC方案进行优化。于是我们决定先进行ISH,随后再进行IHC,这样做的原因在于,消化组织对溶菌酶抗体而言十分重要,而且RNAscope?检测在进行蛋白酶处理之前有一个抗原修复的步骤。

我们主要的挑战在于优化IHC检测,因为蛋白质的稳定性会受到RNAscope?预处理的影响。在将IHC与ISH进行合并为双标记检测之前,一定要确保IHC在不受RNAscope? ISH影响下,已经得到了优化。

我们花费了数周,并进行了大量重复实验后,ISH-IHC双标记法才算真正得到了优化,但是染色结果确实十分漂亮,而且数据也非常有趣。


Q: 您有什么值得分享的建议吗?

Kristie Wetzel

在进行ISH与IHC双标记之前,我建议先单独进行这两个检测分析。首先必须保证单独检测结果有良好的信号,同时也需要意识到,即使单独检测的结果很好,一旦两种检测方法进行合并,仍然需要进行调整和优化。由于RNAscope?预处理,IHC检测一定要进行优化——针对组织类型确定最佳RNAscope?预处理方案同样重要。一旦确立方案,不作任何改变。

我的另外一个建议是完全遵守RNAscope?检测操作方案!按照方案操作会呈现很好的效果

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Q: 您就职单位为The Francis Crick Institute, London, UK.能和我们聊聊您研究的关注点是什么吗?


Bradley Spencer-Dene:

最初,我学习的是有关于哺乳动物胚胎学的内容,我的PhD研究的是颅面发育,但是目前我在核心病理学服务部担任技术专家。我已经对许多人肿瘤和疾病的小鼠模型进行了广泛的研究,并且目前我的研究内容为成纤维细胞生长因子(FGFs)及其受体在生长发育和疾病方面的作用。

Q: 您可否阐述一下您的ISH-IHC双标记法,以及您开发双标记法的原因?


Bradley Spencer-Dene

我们机构针对FFPE小鼠组织已经编译了约400种抗体,同时要求我们不断地测试和优化新的抗体。我们也有越来越多的抗体用于FFPE人组织,以及斑马鱼中。但是,有很多靶点缺乏合适抗体进行IHC检测,因此ISH –尤其是RNAscope? ISH – 可以让我们在小鼠和人组织样本中观察到之前无法获得的目标基因的表达方式和水平。我之前在我自己的研究和核心病理学服务部工作中进行过放射性和非同位素ISH分析。我从1年前开始使用RNAscope? ISH,此后就再未使用过其他替代性技术。

由于研究所研究员的直接要求,我们决定开发一种ISH-IHC双标记检法,其中部分原因也出于科学好奇心促使我们创新。

我们目前采取手工实验进行双标记法,但是我们也有自动化平台(DISCOVERY,Ventana)。进行ISH检测时,我们使用RNAscope?2.5HD Red Assay试剂盒,利用快速红底物自发荧光的优势,将其与Alexa-fluor 488染色的免疫荧光IHC相结合。我们先进行ISH,然后进行IHC。相对于蛋白质抗原决定簇来说,mRNA更不稳定,如果在IHC后检测mRNA更有可能降解,基于这个观点我未尝试将试验顺序颠倒。

我们已经用该方法在小鼠和人正常及肿瘤组织的组织样本和细胞团、组织芯片,以及细胞爬片上进行了检测。我们尝试了5种ISH探针(hPPIB、mPPIB、hPD-L1、mLGR6、hZFP36)和12种抗体(p-ERK、p-HH3、TTF1、α-1-Na/K-ATPase、F4/80、CAM 5.2酸性细胞角蛋白、PD-L1、CD45常见白细胞共同抗原、细胞角蛋白5、细胞角蛋白8、CD3以及活性Caspase 3)。我们选择上述蛋白和探针,是因为我们想观察不同的细胞类型、肿瘤 vs 淋巴细胞浸润以及细胞增殖和凋亡标记物。

通常针对ISH和IHC,我们会使用不同的靶标,但是我成功共染了PD-L1。


Q: 您对双标记法有什么操作建议吗?


Bradley Spencer-Dene:

需要注意那些必须使用胰蛋白酶消化的抗体,例如F4/80。我们发现该抗体不进行反应,因此需要在ISH完成后,在IHC检测开始前加入胰蛋白酶消化的步骤。另外,注意那些会引起降低/猝灭自发荧光的试剂,例如使用溶于70%乙醇的0.1%苏丹黑的方法与快速红RNAscope?信号不兼容。

我建议在室温下于10%中性缓冲福尔马林中将组织固定72小时,首先单独进行RNAscope? ISH和IHC染色,以对两种信号进行定位并确定两种信号的信号强度。我们还发现有必要稀释RNAscope?预处理试剂3(蛋白酶Plus),因此也需要考虑优化该蛋白酶消化步骤。

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小结:尽管我们的专家在进行ISH- IHC双标记操作上有些差异,但是他们却有共同的推荐和建议:

  • 所有ISH-IHC双标记法需要进行优化

  • 建议先进行RNAscope? ISH,然后进行IHC

  • 建议采用RNAscope?预处理试剂单独优化IHC

  • 由于蛋白质会在ISH检测期间发生降解,ISH-IHC双标记法更适合检测表达水平较高的蛋白质

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