Advanced Cell Diagnostics, Inc.(ACD)创立于2006年,坐落于美国加利福尼亚州的硅谷中心,作为新兴的分子病理诊断的领导者,开发了基于细胞和组织测试的RNAscope®专利技术和定量平台, 并可应用于个体化医疗领域。 RNAscope®专利的探针设计提供了一种单细胞单分子水平的RNA原位杂交定量分析方法,是原位杂交领域重大的进步之一,为药物研发及生命科学研究提供了有力的工具。

从高分文献看模式动物器官再生研究--斑马鱼篇

作者:ACD-editor 阅读:129次 时间:2017-10-31 18:17:02

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2017年10月11日至13日,北京大学举办的模式动物器官再生研讨会就器官再生机制,成体干细胞、微环境及募集激活机制,器官再生中的细胞分化与去分化等主题进行研讨。本文以此会议内容为基础,举例阐述RNAscope技术在斑马鱼和小鼠体内,对于心脏,心血管,肝脏,小肠以及尿道器官发育再生的研究应用,揭示RNAscope原位检测技术在该领域的应用优势所在。

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Nrg1 is an injury-induced cardiomyocyte mitogen for the endogenous heart regeneration program in zebrafish

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由于哺乳动物的成年心脏很难实现损伤后的心肌再生,与之相反低等脊椎动物例如成年斑马鱼能够在心脏损伤的情况下通过心肌细胞去分化和增殖,完美地再生损伤的心肌细胞,因而对成年斑马鱼心脏再生的分子学研究有望为成年哺乳动物心脏损伤再生研究提供线索。为此,美国的Duke大学医学中心的Poss, KD及其团队在对Nrg1与成熟斑马鱼心肌损伤修复的研究中,使用RNAscope原位检测技术发现在正常斑马鱼心肌中鲜有nrg1的转录表达,而当对斑马鱼心肌进行心肌消融时,损伤部位的心肌内出现大量nrg1的mRNA信号(下图B-E)。尤其出现在血管周围区域。当在心尖区域进行损伤手术后,nrg1的mRNA也集中在损伤区域周边密集分布(下图G和H)[1]。

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在对Nrg1信号通路在心肌损伤后再生的研究中,该团队建立了一个转基因斑马鱼模型,使用taxmoxifen可以在心肌细胞内诱导表达Nrg1。下图为使用RNAscope方法证实nrg1在该模型中的诱导表达。右图为EGFP对照模型(下图)。在使用taxmoxifen处理3天后,该团队进行了斑马鱼心肌损伤处理,7天后nrg1表达在心肌细胞近损伤再生区域增加了84%。之后的实验证实斑马鱼心肌内nrg1激活可以诱导心脏再生程序,表明Nrg1 促进成年斑马鱼心肌再生并潜在促进非损伤状态的心肌肥大。

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Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish

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在另一篇斑马鱼心肌再生机制的研究中,北京大学分子医学研究所熊敬维课题组阐述了染色质重塑蛋白Brg1在成年斑马鱼心肌再生中的重要作用以及其作用机制,发现SWI/SNF复合体成员Brg1主要是通过Dnmt3ab,增加cdkn1c启动子CpG区域的甲基化,从而抑制cdkn1c的表达以实现心肌再生[2]。

该课题组成员使用了传统原位杂交和RNAscope原位杂交法,分别检测brg1mRNA在心室切除术后不同时间段斑马鱼心脏内的表达情况,以及Brg1调控蛋白CDK抑制物cdkn1a和cdkn1c(下图)的mRNA在心脏心肌细胞内的表达定位。实验发现在对斑马鱼心脏进行了心尖切断术后,心脏内Brg1的表达显著上调,并在手术后3,7和14天达到一个高峰,而在心脏修复结束后的30天,brg1基本检测不到。使用Brg1条件性突变的斑马鱼阻断Brg1蛋白表达,这类斑马鱼在心脏损伤后,心脏纤维化加重,且伴随死亡率增加,心肌再生能力下降。

在接下来对Brg1调控心肌再生的机制研究中,该研究团队使用了RNA-seq的方法,筛选出可能参与Brg1促进心肌细胞增殖和再生的相关基因,并使用RNAscope技术对一系列待检测基因的mRNA进行原位检测。使用ACD公司设计合成的针对斑马鱼cdkn1a和cdkn1c信使RNA的双Z探针,该研究团队发现这两个CDK抑制物在野生型斑马鱼心脏发生以及没有发生心脏损伤时均低表达,而在转基因条件性抑制Brg1后表达显著增加;同时,MF20免疫组化(心肌特异性肌凝蛋白重链)和RNAscope共染确证了cdkn1a和cdkn1c信使RNA特异性富集在心肌细胞内(下图)。进一步研究发现,在转基因斑马鱼体内,由于抑制了Brg1导致心肌细胞增殖受限,心肌纤维化增加,心脏再生能力受损,RNAscope法检测证实这些过程中都伴随着cdkn1a和cdkn1c表达上调。

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Reference:

  1. Elife. 2015 Apr 1;4. doi: 10.7554/eLife.05871. Nrg1 is an injury-induced cardiomyocyte mitogen for the endogenous heart regeneration program in zebrafish.

  2. Nat Commun. 2016 Dec 8;7:13787. doi: 10.1038/ncomms13787. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.

  3. Nature. 2015 Aug 13;524(7564):180-5. doi: 10.1038/nature14863. Epub 2015 Aug 5. Self-renewing diploid Axin2(+) cells fuel homeostatic renewal of the liver.

  4. Nat Cell Biol. 2016 May;18(5):467-79. doi: 10.1038/ncb3337. Epub 2016 Apr 18. The RSPO-LGR4/5-ZNRF3/RNF43 module controls liver zonation and size.

  5. Science. 2015 Jun 26;348(6242):aaa6071. doi: 10.1126/science.aaa6071. HEART DEVELOPMENT. Integration of Bmp and Wnt signaling by Hopx specifies commitment of cardiomyoblasts.

  6. Development. 2016 Jan 1;143(1):88-100. doi: 10.1242/dev.125286. Epub 2015 Nov 9. Neural crest cell-autonomous roles of fibronectin in cardiovascular development.

  7. Development. 2017 Sep 1;144(17):3177-3188. doi: 10.1242/dev.149112. Epub 2017 Jul 13. Cellular heterogeneity in the ureteric progenitor niche and distinct profiles of branching morphogenesis in organ development.

  8. Development. 2017 Mar 15;144(6):1045-1055. doi: 10.1242/dev.138453. Epub 2016 Dec 7. In vitro patterning of pluripotent stem cell-derived intestine recapitulates in vivo human development.

  9. Nat Commun. 2015 Apr 10;6:6810. doi: 10.1038/ncomms7810. Pontin functions as an essential coactivator for Oct4-dependent lincRNA expression in mouse embryonic stem cells.


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