Advanced Cell Diagnostics, Inc.(ACD)创立于2006年,坐落于美国加利福尼亚州的硅谷中心,作为新兴的分子病理诊断的领导者,开发了基于细胞和组织测试的RNAscope®专利技术和定量平台, 并可应用于个体化医疗领域。 RNAscope®专利的探针设计提供了一种单细胞单分子水平的RNA原位杂交定量分析方法,是原位杂交领域重大的进步之一,为药物研发及生命科学研究提供了有力的工具。

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从高分文献看模式动物器官再生研究--心血管、肝脏、小肠及尿道器官篇

作者:ACD-editor 阅读:1928次 时间:2017-11-13 14:41:50

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Self-renewing diploid Axin2+ cells fuel homeostatic renewal of the liver

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在2015年发表在Nature的这项研究之前,有关成体肝脏内的新生肝细胞来源以及分子调节机制尚无明确答案。美国Stanford University School of Medicine的研究团队通过RNAscope方法确定了Wnt信号依赖的转录靶基因Axin2的mRNA只分布在中心血管周围的肝细胞内。且这些细胞内具有肝前体细胞特有的Tbx3 mRNA标记物,提示肝脏前体细胞分布在中心静脉周边(下图)[3]。

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在明确了Axin2阳性细胞只特异性的位于中心静脉周围之后,该团队使用RNAscope的方法原位检测了19个Wnt家族的成员,发现Wnt2和Wnt9b特异性的表达在中心静脉内皮细胞内,这些Wnt信号与内皮细胞表面标记物Pecam1共定位(下图)。

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这一发现提示位于中心静脉内皮细胞内的Wnt信号很有可能是调节Axin2+肝脏前体细胞的信号因子。为了验证这一猜想,该研究团队制备了Wlsf/f/小鼠,使用RNAscope方法证实当Wnt信号丢失时,中心静脉周边的肝细胞内Axin2阳性细胞也明显下降。与此同时,Wnt信号的另一个靶基因-谷氨酰胺合成酶(GS)表达水平也下降。从而证实了中心静脉的Wnt信号为维持肝脏前体细胞提供了特定的微环境。

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在这项研究中,由于较难找到特异性免疫组华抗体以及技术上无法实现某些特异性抗体制备,该团队从Anxin2到19种Wnt家族成员,到肝脏干细胞表面标记物Tbx3以及Wnt信号下游基因产物GS的检测都是通过RNAscope方法进行原位mRNA定位的。

 

在确定了Wnt信号通路是维持肝脏前体细胞的基础上,2016年另一篇发表在Nature Cell Biology 的文章进一步对肝脏Wnt信号通路的调控机制进行了研究。

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The RSPO-LGR4/5-ZNRF3/RNF43 module controls liver zonation and size

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三十年前,K. Jungermann 发现肝细胞虽然在组织学上看没有差异,但是其实沿着门静脉-中心静脉轴的分布,细胞与细胞之间有着不同的生物学功能。构成了肝代谢区带的概念。根据这个观念,肝小叶内的不同区域内进行着不相互重跌但互补的代谢功能,用以维持肝脏的整体功能。之前的研究证实Wnt/ β-catenin信号通路是控制代谢区段平衡的主要信号通路。但是,对于调节Wnt/ β-catenin信号通路的机制研究并不多。瑞士诺华公司,英国爱丁堡大学以及美国剑桥大学等多家科研人员对这个问题进行了研究,发现肝脏是通过RSPO配体与肝细胞表面受体LGR4/5结合,清除细胞表面的ZNRF3/RNF43,从而导致Wnt受体的细胞膜转位,促进Wnt配体通过Wnt/ β-catenin信号通路对肝细胞的作用,从而调控肝脏代谢区带。

在这项研究中,通过RNAscope技术首先确认了在小鼠肝脏内,Wnt/β-catenin信号通路激活转录的Axin2 mRNA在肝脏不同区域的分布,以及Lgr4, Lgr5, Znrf3的mRNA分布情况。确认Lgr4和Lgr5在中心静脉周边共定位,且该区域存在Wnt/β-catenin通路活化[4]。

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接着的通过基因敲除制备了Lgr4, Lgr5, Lgr4/5敲除小鼠模型,并通过RNAscope方法证实敲除成功,没有Lgr4 Lgr5的mRNA的转录(下图)。进一步的实验发现在敲除了Lgr4和同时敲除Lgr4/5受体之后,Wnt/β-catenin信号通路依赖基因GS和CYP2E1的蛋白表达都明显降低,表明Lgr4和Lgr5受体是肝脏zonation代谢所必需的。


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在肝脏内加入外源性RSPO1,RNAscope方法证实有活化的Wnt/信号通路下游基因产物Axin2的mRNA转录,同时出现肝细胞再生(Ki67组化结果)。从而进一步证实RSPO1可以促进肝脏再生。

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Integration of Bmp and Wnt signaling by Hopx specifies commitment of cardiomyoblasts

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2015年 发表在 science的这篇文章研究了Hopx分子在心脏发育过程中的作用。实验发现在心肌细胞分化过程中表达Hopx,并与smad4形成复合物,其作用是与Bmp信号通路协同抑制Wnt信号通路基因产物,从而促进心肌细胞的分化形成,为心肌分化以及心脏前体细胞状态维持的机制研究提供了数据[5]。

在实验中,作者通过RNAscope的方法确定了胚胎E9.5天小鼠的心管扩张期出现Bmp4转录因子的表达。随着外源性加入Bmp4,可以观察到HOPX与Smad4结合增强,提示BMP4在HOPX与SMAD4结合中的作用(下图)。而在胚胎9.5-10天,可以观察到Hopx与活化的SMAD4形成复合体。


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在胚胎9.5-10.5天,RNAscope法证实野生小鼠与Hopx敲除小鼠胚胎内的Bmp4和Bmp2的mRNA表达不发生影响(下图),但是当外源性给予Bmp4时,Wnt信号分子下游基因产物Axin2的表达在野生小鼠内明显低于Hopx敲除小鼠。提示Hopx对于Wnt信号通路抑制起到重要作用(下图)。

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Neural crest cell-autonomous roles of fibronectin in cardiovascular development

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在另一项心脏血管的研究中,美国费城移植医学中心的Astrof S和Wang X在对从神经脊发生的主动脉弓内血管平滑肌分化形成的研究中,深入探讨了Fn1以及Notch信号通路的作用。该研究首先制备了Fn1基因缺失小鼠,并通过RNAscope的方法证实了Fn1在神经脊内转录下调(下图C-E)[6]。

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接接着,在对神经脊(NC)合成的Fn1调节Notch信号通路的研究中,RNAscope方法证实了敲除Fn1后,Notch信号通路下游基因产物Hey1, Hey2的转录在神经脊而非内皮细胞内发生下调,而Notch1和Notch3的基因产物没有影响(下图)。

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IIntegrin α5β1被认为是Fn1主要的信号转导因子。当在神经脊条件性敲除Integrin α5β1后,心脏主动脉弓分化受阻,RNAscope方法发现Notch信号基因产物Hey1, Hey2的mRNA转录下调,从而提示Fn1通过Integrin α5β1对血管平滑肌细胞的Notch信号通路进行调节。

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Cellular heterogeneity in the ureteric progenitor niche and distinct profiles of branching morphogenesis in organ development

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在哺乳动物肾脏内,输尿管分支末端(UBT)的上皮前体细胞群形成尿道转运收集系统。在南加利福尼亚以及加利福尼亚大学的研究中,通过RNA-seq鉴别出尿道发育系统内输尿管终端和输尿管柄的富集基因。这些基因通过原位检测方法进行了验证。通过RNAscope duplex assay,该研究在组织切片内同时定位Wnt11与Ret基因的表达模式以及Vldlr与Ret的表达分布,发现Vldlr比Ret更加接近输尿管柄(下图)[7]。

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In vitro patterning of pluripotent stem cell-derived intestine recapitulates in vivo human development

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消化道不同的区域存在不同的吸收特性,美国加利福尼亚大学为首的研究团队使用胚胎干细胞来源的肠道类器官研究鉴别消化道分化过程中呈现区域特异性表达的基因。研究发现当短时间暴露在FGF4和CHIR99021下时,人类胚胎干细胞分化成为十二指肠类器官;当长时间暴露在FGF4和CHIR99021下时,胚胎干细胞分化成为回肠类器官。将这些分化后的类十二指肠和类回肠移植到免疫缺陷小鼠体内,移植器官表现出该区域肠组织应有的特性。在这个研究中,通过RNAscope方法定位了三个不同区域消化系统的特异表达的基因,包括ONECUT2, GUCA2A和DMBT1在原位的转录(见下图),以验证类器官的趋向性[8]。

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Pontin functions as an essential coactivator for Oct4-dependent lincRNA expression in mouse embryonic stem cells

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在另一项发表在nature communication的胚胎干细胞研究中,首尔大学的研究团队研究了Pontin在胚胎干细胞分化过程中作用,证实了其与Oct4这一维持胚胎干细胞的关键性转录因子之间的关系。该研究首先通过条件性敲除小鼠胚胎干细胞内的Pontin基因,发现Pontin缺失的ES无法维持其未分化状态。在对Pontin靶基因的鉴别实验中,通过条件性敲除Pontin并进行mRNA测序,发现Pontin敲除后很多ES分化相关基因出现高表达,而细胞周期以及代谢有关的基因产物下调。经比对证实Pontin敲除后的mRNA谱与Oct4敲除的具有强相关性。Chip结果进一步证实了Oct4与Pontin相互结合。在接下来的lincRNA的研究中,RNAscope检测方法确认linc1253只位于ES的细胞核内(下图),当外源性加入linc1253后,可以有效阻断由于Oct4或Pontin缺失导致的ES细胞分化的进程,提示linc1253是Oct和Pontin的下游基因,维持ES的干细胞特性[9]。

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Reference:

  1. Elife. 2015 Apr 1;4. doi: 10.7554/eLife.05871. Nrg1 is an injury-induced cardiomyocyte mitogen for the endogenous heart regeneration program in zebrafish.

  2. Nat Commun. 2016 Dec 8;7:13787. doi: 10.1038/ncomms13787. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.

  3. Nature. 2015 Aug 13;524(7564):180-5. doi: 10.1038/nature14863. Epub 2015 Aug 5. Self-renewing diploid Axin2(+) cells fuel homeostatic renewal of the liver.

  4. Nat Cell Biol. 2016 May;18(5):467-79. doi: 10.1038/ncb3337. Epub 2016 Apr 18. The RSPO-LGR4/5-ZNRF3/RNF43 module controls liver zonation and size.

  5. Science. 2015 Jun 26;348(6242):aaa6071. doi: 10.1126/science.aaa6071. HEART DEVELOPMENT. Integration of Bmp and Wnt signaling by Hopx specifies commitment of cardiomyoblasts.

  6. Development. 2016 Jan 1;143(1):88-100. doi: 10.1242/dev.125286. Epub 2015 Nov 9. Neural crest cell-autonomous roles of fibronectin in cardiovascular development.

  7. Development. 2017 Sep 1;144(17):3177-3188. doi: 10.1242/dev.149112. Epub 2017 Jul 13. Cellular heterogeneity in the ureteric progenitor niche and distinct profiles of branching morphogenesis in organ development.

  8. Development. 2017 Mar 15;144(6):1045-1055. doi: 10.1242/dev.138453. Epub 2016 Dec 7. In vitro patterning of pluripotent stem cell-derived intestine recapitulates in vivo human development.

  9. Nat Commun. 2015 Apr 10;6:6810. doi: 10.1038/ncomms7810. Pontin functions as an essential coactivator for Oct4-dependent lincRNA expression in mouse embryonic stem cells.


延伸阅读:

RNAscope在斑马鱼中的应用研究—RNAscope在模式动物组织器官再生研究中的应用(一)

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