Advanced Cell Diagnostics, Inc.(ACD)创立于2006年,坐落于美国加利福尼亚州的硅谷中心,作为新兴的分子病理诊断的领导者,开发了基于细胞和组织测试的RNAscope®专利技术和定量平台, 并可应用于个体化医疗领域。 RNAscope®专利的探针设计提供了一种单细胞单分子水平的RNA原位杂交定量分析方法,是原位杂交领域重大的进步之一,为药物研发及生命科学研究提供了有力的工具。

2017年9月CNS发表文章总结—RNAscope应用举例

作者:ACD-editor 阅读:5854次 时间:2018-01-17 18:31:53

导语

2017年9月,在《Cell》及其子刊《Cell Reports》、《Cell Metabolism》,《Nature》子刊《Scientific Reports》和AAAS旗下刊物《Science Signaling》上线发表了8篇使用RNAscope方法的文章。这8篇文章分别就血管周皮细胞在中枢神经系统再生中促进少突胶质祖细胞分化的作用[1],长链非编码RNA Egr2-AS-RNA在外周神经脱髓鞘过程中的作用[2],RXFP1的小分子激活剂在肝癌纤维化治疗中的前景[3],Cdk5在多脑回哺乳动物大脑皮层沟回形成中的重要作用[4],GPR15与GPR15L在银屑病脂类皮肤治疗中的潜在作用[5],一型糖尿病病人胰岛中残存胰岛素以及前胰岛素的情况[6], Neto调控突触前红藻氨酸受体从而发挥调节神经网络的作用[7],以及肺中不同种系的间叶细胞群发挥的调节上皮细胞自我更新及肌纤维化的作用[8]进行了研究

  本文就以上8篇文章的内容,以及如何通过使用RNAscope技术解决其研究过程中的基因定位需要总结如下。

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当中枢神经系统发生病理性的髓鞘脱失时,少突胶质祖细胞发生增殖并通过脉管支架迁移至损伤的病灶部位,分化为具有髓鞘再生功能的少突胶质细胞。髓鞘的再生可以修复跳跃式传导并且使得轴突得以存活。因此促进髓鞘再生是以慢性髓鞘脱失为主的疾病的重要治疗目标。周皮细胞主要位于毛细血管的管腔面的基膜内,具有与间充质干细胞相似的特征和功能,既往的研究表明周皮细胞具有调控血管形成和微脉管血流的功能。以英国剑桥大学Rivear FJ为首的多国研究团队证实中枢神经系统固有的周皮细胞可以促进少突胶质祖细胞的分化,并且发现周皮细胞分泌的Lama2是发挥这一作用的主要细胞因子。这些结果说明周皮细胞的功能并不仅仅局限于血管稳态,更与中枢神经系统的再生相关。

在对小鼠周皮细胞进行原位检测观察其与髓鞘定位关系时,由于缺乏高效特异的免疫组化抗体,该研究团队使用了RNAscope Multiplex Fluorescent Assay 原位对周皮细胞特异性标志物 PDGFRb(绿色信号点), CD13(灰色信号点)以及其分泌的Lama2(红色信号点)的mRNA定位进行了检测,证实了周皮细胞促髓鞘再生的机制。

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既往的动物实验证实转录因子EGR2在外周神经系统血旺细胞产生髓鞘的过程中具有重要的功能。神经调节蛋白可以通过ERK1/2通路激活转录因子YY1来启动EGR2的转录并调控其表达状态。有报道指出YY1同时可作为一种RNA结合蛋白衔接长链非编码RNA和染色质位点。美国宾夕法尼亚州Geisinger Clinic实验室,以Tapinos N 为首的研究团队发现长链非编码RNA Egr2-AS-RNA能够反义作用于EGR2的启动子区域。进一步实验表明,在外周神经修复中Egr2-AS-RNA与EGR2的表达呈负相关。而在背根神经节中异位过表达Egr2-AS-RNA能够抑制 Egr2 mRNA的表达并且诱导产生病理性的髓鞘脱失。在动物坐骨神经节损伤实验模型中,抑制Egr2- AS-RNA 的表达可以恢复EGR2相关表达谱并显著延缓病理性髓鞘脱失。进一步研究发现衔接蛋白YY1第184位丝氨酸位点的磷酸化状态直接影响Egr2-AS-RNA与EGR2的结合情况。

为了明确长链非编码RNA-Egr2-AS-RNA是否特异性的定位在小鼠坐骨神经中,该研究团队使用了RNAscope? Multiplex Fluorescent assays的方法,观察Egr2-AS-RNA与坐骨神经特异性标记物S100b的RNA的共定位状况,证实了该长链非编码RNA存在于S100b mRNA阳性的细胞浆与细胞核内,为下一步的研究提供了形态学数据支持。

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肝纤维化或肝硬化是大部分肝损伤的最后状态,表现为正常肝组织的减少,正常血流的破坏,紊乱的再生肝细胞结节并最终导致肝功能失代偿,目前有动物实验和器官研究模型提示肝硬化这一过程是可逆的。人松弛素2(H2-RLX)具有调控心血管及肾脏,抗炎和抗纤维化的作用,而其受体(RXFP1)属于G蛋白偶联受体并在不同器官均有存在。已有报道指出在动物模型及肝纤维化的疾病模型内均发现RXFP1的表达增加,而当外源性加入H2-RLX后可显著缓解肝纤维化,这一作用呈现RXFP1依赖模式。提示 H2-RLX/RXFP1受体配体有望成为肝纤维化潜在的治疗靶点。然而由于松弛素在体内半衰期较短,需要长期静脉给药或皮下给药,造成了其应用上的限制。英国Queen’s Medical Research Institute的JAF为首的团队通过筛选改良得到了一种RXFP1的小分子激活剂,检测发现其在人胚肾HEK293细胞和人肝癌LX-2细胞中具有活化RXFP1的效应。

由于缺乏特异高效的免疫组化抗体,JAF等人在病人样本中通过RNAscope的方法首先检测了RXFP1基因转录产物(下图剪头所示)在自身免疫性肝炎(AIH)和非酒精性肝炎(NASH)活检样本中与疾病进展程度的相关性,发现RXFP1 mRNA特异性的定位在纤维瘢痕区域,且不与表达肝星状细胞表面标记物α-SMA分布在同一成纤维细胞中。

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哺乳动物大脑皮层沟回的存在被认为是为了在有限的颅腔内分布更多的皮层神经元。但是由于对多脑回进行基因水平操作几乎不可能,故很难对皮层发生折叠的机制进行研究。由于典型的无脑回畸形患者中常出现CDK5的突变,提示该因子在皮层沟回形成机制中具有重要作用。日本金泽大学以Hiroshi Kawasaki为首的研究团队通过结合utero electroporation和CRISPR/Cas9技术,成功有效地在白鼬大脑中敲除Cdk5基因。 结果表明敲除Cdk5后显著损害了皮层沟回的形成。研究者进一步将CDK5导入特定的皮层,发现在皮层沟回形成的过程中,相对于下层神经元,上层神经元中的CDK5发挥了主要功能。当CDK5表达下降时,显著抑制皮层神经元的迁移。综上所述,研究者认为,上层神经元中CDK5对其定位有非常重要的调控作用并直接影响了大脑皮层沟回的形成。

由于缺乏针对白鼬CDK5的有效抗体,该研究团队使用了RNAscope 2.5 HD detection reagent kit,定位检测出生后六天白鼬大脑皮层中的CDK5 mRNA的分布,证实了 CDK5 mRNA 主要定位于白鼬大脑皮层的外板。A、C图)

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GPR15属于G蛋白偶联受体,是猿猴免疫缺陷病毒和HIV-2病毒感染所需的受体,它的作用是诱导体内的效应T细胞从初始部位迁移到结肠的粘膜以及皮肤上。瑞士诺华生物医学研究中心的Frédéric Bassilana研究团队从猪的结肠组织纯化提取了GPR15配体类似物,并对其功能进行了研究。在人体内,该配体命名为GPR15L,由C10ORF99基因编码,与CC家族趋化因子具有相似的特性。GPR15L位于人和小鼠与环境接触一侧的上皮细胞,包括结肠和皮肤。在人的宫颈也分布着大量的GPR15L。GPR15L在银屑病缺损区域的免疫反应和疾病过程中可以被检测到。当把Gpr15l缺陷小鼠的皮肤移植到野生小鼠皮肤,可以起到一定程度的保护作用,提示GPR15与GPR15L在产生效应性T细胞反应中的作用。提示了该配体与受体组合在调节上皮免疫平衡以及例如银屑病脂类皮肤治疗中的潜在作用。

在对小鼠Gpr15l进行组织分布和表达量的研究过程中,由于Gpr15l为新发现配体,没有有效的免疫组化检测抗体,该研究团队使用了RNAscope技术,对结肠和皮肤组织上皮细胞内的该配体分布进行了定位研究(蓝色),并使用RNAscope方法的后续定量软件对结果进行了定量分析。

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近年来的研究结果针对经典的I型糖尿病(T1D)病人胰岛β细胞完全损毁这一观点提出了质疑。研究发现在长期患I型糖尿病的病人体内仍有C肽可以被检测出来。佛罗里达大学糖尿病研究所的Mark Atkinson团队研究了T1D病人组,自身抗体阳性组以及对照组胰腺组织内前胰岛素,胰岛素,C肽以及胰岛淀粉样多肽在蛋白和基因表达水平的差异。结果发现在T1D组病人中胰岛素和C肽检测不到,但是在大多数T1D的胰腺内可以检测到前胰岛和胰岛素(INS)的mRNA。用于编码前胰岛素转化酶PCSK1的表达在T1D胰腺中下调,从而为前胰岛素持续存在提供了条件。

在该研究中,除了使用免疫组化的方法对胰岛素蛋白进行定位,该研究团队同时使用了RNAscope 2.0 High Definition kit原位定位前胰岛素mRNA的分布(下图F-G),从而在基因转录和翻译水平对I型糖尿病病人胰岛以及散在分布的单个细胞分泌胰岛素以及前胰岛素进行评估,证实了I型糖尿病病人胰腺内仍然存在胰岛素以及前胰岛素mRNA。

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红藻氨酸受体(KAR)是一种配体门控离子通道型受体,可以与离子通道偶联形成受体通道复合物介导突触电活动。KAR由5条不同功能和药理性质的亚基(Gluk1-5)以组合的方式形成四聚体。既往研究指出辅助亚基Neto1/Neto2可以调控Gluk1-5组装的过程从而影响KAR的生物学功能,而相关的直接证据还很有限。由于Neto对KAR的调控作用具有Gluk亚型特异性,因此理论上也应该具有细胞特异性。NIH的Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development以Chris J. McBain为首的团队通过实验发现,在Neto2敲除型和野生型的特定中间神经元中(包含SOM、CCK/CB1、PV),均可激活KAR,但在Neto1敲除的情况下则丧失了该作用,说明KAR对此类中间神经元的调控与Neto1的表达情况相关。与此相反, 在CCK/CB1中间神经元中,突触前KAR是受Neto1/2共同调控的。以上数据说明 Neto1 在不同的中间神经元中均可以调控突触中KAR,并且证实在抑制性突触前末梢中Neto1/2对突触前KAR均具有调节作用。

由于缺乏小鼠免疫组化Neto抗体,与此同时需要原位检测Neto1/2 在SOM, CCK/CB1和PV阳性中间神经元中的定位,故该研究团队选用了RNAscope Fluorescent Multiplex kit (Advanced Cell Diagnostics),Neto1, Neto2以及Sst, Cnr1和Parvb的同定位进行了原位共定位,并进行了定量分析(如下图)。阐明了Neto在KAR中的作用。

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肺是结构复杂的器官,由不同种的上皮和间叶细胞组成的不均匀混合物。本文的研究者来自费城儿童医院Edward E. Morrisey为首的研究团队使用单细胞RNA测序和信号种系报告系统得到了不同种肺间叶细胞的空间和转录组图谱。研究者发现每一种间叶细胞都有其独特的空间定位和转录模式,导致了其组成独特的具有调节功能的细胞小室。进一步研究发现,间叶肺泡细胞小室是受WNT信号通路调节, 表达PDGFRα并且对肺泡上皮细胞的生长和自我更新有重要调节作用。相反的,在遭受损伤时,Axin2阳性的成纤维祖细胞优先地分化为病理损害性的成纤维细胞类型。研究者又对肺泡细胞小室分泌蛋白质组以及受体蛋白质组进行了分析,发现了II型肺泡祖细胞中具有调控生长和自我更新的信号通路,包括IL-6/Stat3, Bmp,和Fgf等。这些数据展示了不同种肺间叶细胞小室及其分子框架,并且揭示了这种发育途径在病理损伤和组织自我更新中的重要作用。

为了明确肺组织中成纤维祖细胞(AMP)的空间定位情况,需要在小鼠体内原位标记Aoc3阳性细胞。由于没有特异性针对小鼠Aoc3的组化抗体,该研究团队使用RNAScope技术,定位了Aoc3 mRNA阳性AMP细胞在肺组织中的分布和定位,结果显示AMP空间定位于细支气管周间叶(pbm-斑点处)(下图)。

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Reference:

1.Ag, D. L. F., Lange, S., Silva, M. E., Gonzalez, G. A., Tempfer, H., & Van, W. P., et al. (2017). Pericytes stimulate oligodendrocyte progenitor cell differentiation during cns remyelination. Cell Reports, 20(8), 1755.

2.Martinezmoreno, M., O'Shea, T. M., Zepecki, J. P., Olaru, A., Ness, J. K., & Langer, R., et al. (2017). Regulation of peripheral myelination through transcriptional buffering of egr2 by an antisense long non-coding rna. Cell Reports, 20(8), 1950.

3.Mcbride, A., Hoy, A. M., Bamford, M. J., Mossakowska, D. E., Ruediger, M. P., & Griggs, J., et al. (2017). In search of a small molecule agonist of the relaxin receptor rxfp1 for the treatment of liver fibrosis. Scientific Reports, 7(1), 10806.

4.Shinmyo, Y., Terashita, Y., Dinh Duong, T. A., Horiike, T., Kawasumi, M., & Hosomichi, K., et al. (2017). Folding of the cerebral cortex requires cdk5 in upper-layer neurons in gyrencephalic mammals. Cell Reports, 20(9), 2131.

5.Suply, T., Hannedouche, S., Carte, N., Li, J., Grosshans, B., & Schaefer, M., et al. (2017). A natural ligand for the orphan receptor gpr15 modulates lymphocyte recruitment to epithelia. Science signaling, 10(496), eaal0180.

6.Wasserfall, C., Nick, H. S., Campbell-Thompson, M., Beachy, D., Haataja, L., & Kusmartseva, I., et al. (2017). Persistence of pancreatic insulin mrna expression and proinsulin protein in type 1 diabetes pancreata. Cell Metabolism, 26(3), 568.

7.Wyeth, M. S., Pelkey, K. A., Yuan, X., Vargish, G., Johnston, A. D., & Hunt, S., et al. (2017). Neto auxiliary subunits regulate interneuron somatodendritic and presynaptic kainate receptors to control network inhibition. Cell Reports, 20(9), 2156.

8.Zepp, J. A., Zacharias, W. J., Frank, D. B., Cavanaugh, C. A., Zhou, S., & Morley, M. P., et al. (2017). Distinct mesenchymal lineages and niches promote epithelial self-renewal and myofibrogenesis in the lung. Cell,170(6), 1134.




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